摘要 氧化還原電位(Eh)是煤層生物甲烷生成的重要控制因素之一。為了解其對煤層生物甲烷產出的影響以及產甲烷的動力學過程，在實驗室采用-l02 mV、-l53 mV、-208 mV、-284 mV、-315 mV這5個氧化還原電位值，對河南義馬低煤階煤樣品進行了生物甲烷模擬產出實驗，采用氣相色譜儀對不同反應階段生成氣體的成分及生成量進行檢測，同時對菌種源中微生物進行培養(yǎng)計數。結果表明：①不同Eh條件下的實驗均有甲烷的生成，氧化還原電位較低時產甲烷菌的繁殖更加快速，在-284 mV時生物甲烷的濃度最大，-l02 mV時最?。?span lang="EN-US">②通過平板計數法，分析了產甲烷過程和細菌生長動力學機理——整個產甲烷生成過程也是微生物生長代謝的過程，間接證明了產氣量大小變化的原因。結論認為，Eh對于煤層生物甲烷的生成具有重要的控制作用。

關鍵詞  氧化還原電位  低煤階  煤層  生物甲烷  生成  影響  微生物  平板計數法

煤層生物甲烷是微生物在適宜的溫度、介質條件下對中低煤階煤作用生成的以甲烷為主的氣體。由于氧化還原電位(Eh)對微生物活性有著明顯的影響作用^[1-4]，因而對生物甲烷的生成也會產生一定程度的影響^[5-9]。Hae Sung Jee等發(fā)現(xiàn)甲烷菌的最佳生長速率和產甲烷速率在Eh介于-370～-500 mV時為最高^[10]。Fetzerh和Conrad指出Eh為+100 mV時可抑制甲烷菌生成甲烷^[11]，但這些研究僅限于解決農村能源緊缺與污水處理問題的需要^[12-14]，而對于Eh影響煤降解生物產甲烷卻鮮有報道。

為了解Eh對生物氣產出的影響及產甲烷的動力學過程，筆者在模擬低煤階煤層生物甲烷產出的實驗時，對不同Eh條件下的甲烷生成量進行了檢測，同時探討了煤層甲烷生成能力及細菌生長代謝動力學機理。

1 實驗材料和方法

1．1 實驗用煤樣

實驗所用煤樣為采自河南義馬常村礦的中侏羅統(tǒng)義馬組2層長焰煤，煤質分析結果如表1所示。實驗采用沼液作為外加菌種源^[13]，采自焦作市馬村區(qū)農家沼氣池。煤樣粉碎至60目，充分烘干后備用。

1．2 實驗室模擬生物甲烷生成實驗

筆者主要研究不同氧化還原電位條件下生物甲烷的生成量及其變化規(guī)律，并探討甲烷在不同反應階段的生成方式。

1．2．1 產氣實驗

為探討不同Eh對CH₄生成量的影響，本實驗以向反應樣品加入同體Na2S的方法調節(jié)Eh。稱取處理后的煤樣若干份，l0 g／份，每份加入100 ml，沼液和20 ml。白腐真菌菌液。每個樣品做2個平行樣，實驗結果取其平均值。樣品分裝于250 ml。錐形瓶中，連接排水集氣裝置后迅速密封，并做未加煤的空白樣以對比，實驗結果已去除空白樣產氣干擾，樣品分裝情況如表2所示。

樣品密封后放入恒溫生化培養(yǎng)箱中，35℃恒溫下培養(yǎng)60 d。由于本實驗以沼液做外加菌種源，為排除沼液的自產氣量，實驗另增設2個沼液平行樣，實驗結果中的CH₄生成量為除去沼液影響后煤轉化產出的CH₄量。

1．2．2 細菌的平板計數法實驗

在產氣實驗結束后，對每組反映瓶中的細菌進行分離培養(yǎng)，然后進行平板計數。由于礦井水中菌種濃度較低，故采用活菌計數法對主要菌種進行計數。活菌計數法，旨在讓每個活細菌在適宜的培養(yǎng)基和良好的生長條件下都可以通過生長形成菌落。

具體操作步驟如下：

1)配置培養(yǎng)基和生理鹽水。

2)將配好的藥品、試劑等高壓滅菌。

3)取出滅菌后的物品，放入厭氧工作站內，倒平板，待平板冷卻后備用。

4)用稀釋倍數法把細菌接種到相應的平板上。

5)將接種好的平板置于厭氧罐內，利用多功能智能厭氧裝置抽真空后充入混合氣(甲烷、氫氣和氮氣)，于恒溫培養(yǎng)箱(37℃)中，進行為期90 d的培養(yǎng)。

1．3 檢測方法

氣體的生成量、成分及濃度的檢測利用北分-瑞利SP-2100型氣相色譜儀。采用進樣針手動進樣，每次取氣體樣1 mL，每個樣進2次，取平均值以減少手動進樣誤差。

2 實驗結果與分析

實驗結果表明：在實驗室條件下，樣品在不同Eh條件下均可持續(xù)生成CH₄，同時生成了C0₂、N₂及其他氣體。不同Eh條件下氣體生成量及氣體濃度如表3，圖l、2所示。

1)不同Eh條件下，煤樣的氣體生成總量不同。隨Eh的降低，產氣量也逐漸增大，在Eh為-284 mV和-315 mV時，產氣量最多，分別為28．6 mL／g和22．0 mL／g，Eh為-l02 mV時，產氣量最少，為5．8mL／g，這說明隨著Eh的降低，產氣總量基本趨勢是變大的。

2)不同Eh條件下，煤樣的CH₄生成量和濃度與生成氣體總量的變化趨勢類似，從-102 mV到-315mV，呈總體逐漸上升趨勢，在-284 mV時和-315mV時分別為22．6l mL／g和18．79mL／g。在-284mV和-315 mV時，出現(xiàn)了氣體總量和甲烷的產量稍微減少的情況，這可能是隨著氧化還原電位的減少，南于在調節(jié)相對較低的脅值時所需用的藥品硫化鈉的投放量也相應增大，而硫化鈉的過多投入對細菌有一定的毒害作用，造成產甲烷菌的生長和代謝受到抑制，酶作用動力不足，降解活性減弱，所以導致產氣量反而相對減少。

3)Eh值對菌種總量的影響。實驗結束后對反應瓶中的細菌進行接種培養(yǎng)，并采用活菌計數法對菌種量進行計數得出表4。

從接種培養(yǎng)的結果可以看出，細菌的生長個數與氧化還原電位有一定的關系，在高氧化還原電位時產甲烷菌的數量較少，隨著氧化還原電位的降低，基本趨勢是細菌生長的個數越來越多。由此認為，氧化還原電位是產甲烷發(fā)酵的重要限制因子，較低的適合的氧化還原電位可以促進產甲烷菌體內的酶系的活性，使其調整代謝方式和速率，加快生長繁殖。另對-284mV的氧化還原電位值的產甲烷菌進行為期90d的培養(yǎng)觀察，菌種的平板培養(yǎng)結果如圖3～5所示。

微生物的生長特性與生物甲烷的產出過程密切相關的：經過厭氧處理，放入37℃的恒溫培養(yǎng)箱；大約7 d細菌開始適應繁殖并逐漸生長，如圖4星點狀的細菌分布；再經過30 d左右進入對數生長期后，細菌的生長速度增至最大，細菌數量以幾何級數增加，細菌數逐漸連成一片，由于細菌的快速繁殖消耗了大量的營養(yǎng)物質，致使培養(yǎng)基濃度降低，進入穩(wěn)定期。穩(wěn)定期的細菌總數達到最大值，并恒定一段時間，從圖5可看出呈樹枝狀的為穩(wěn)定期，新生的細菌數和死亡的細菌數相當。繼穩(wěn)定期之后，大約60 d培養(yǎng)基營養(yǎng)成分被耗盡，細菌因缺乏營養(yǎng)而利用儲存物質進行內源呼吸，死菌數大于新生菌數，細菌群體進入衰亡期。試驗圖示證明：整個產甲烷過程也是微生物生長代謝的過程。

3 結論

筆者在實驗室條件下模擬了不同Eh條件下生物甲烷生成的情況，對不同條件下產出的氣體及甲烷含量進行分析，并對甲烷在不同反應階段的生成方式進行了探討，實驗結果表明：

1)Eh對甲烷的生成具有重要的影響作用，較低的氧化還原電位對產甲烷菌的生長有利，Eh在-284mV時最適宜甲烷的生成，此時生成的氣體總量和甲烷氣體濃度為最大。

2)通過對實驗結束后反應瓶中的產甲烷菌進行培養(yǎng)計數，經幾十天的培養(yǎng)和連續(xù)觀察也可以得出產甲烷菌生長代謝的全過程，間接證明了產氣量最大的原因。

參考文獻

[1] APHA．Standard methods for the examination of water and wastewater[s]．Washington DC：American Public Health Association，1998．

[2] DIAS J M L，LEMOS P C，SERAFIM l．S，et al．Recent advances in polyhydroxyalkanoate production by mixed aerobic cultures：from the substrate to the final product[J]．Macromolecular Bioscience，2006，6(11)：885-906．

[3] 劉朋波，徐佳杰，付水林，等．l，3-丙二醇發(fā)酵中氧化還原電位的變化與控制[J]．化學與生物T程，2008，25(3)：45-48．

[4] 鄭繼岱，徐國謙，儲炬，等．利用氧化還原電位調控乳酸發(fā)酵[J]．生物加工過程，2008，5(6)：73-77．

[5] 李明宅，張洪年，劉華，等．生物氣模擬試驗的進展[J]．石油與天然氣地質，l996，17(2)：117-122．

[6] SFIDH J，EITEMAN M A．Influence of redox potential on product distribution in Clostridium thermosuccinogenes[J]．Applied Biochemistry and Biotechnology，1 999(82)：91-101．

[7] 李明宅，張輝．煤的厭氧降解產氣作用[J]．天然氣工業(yè)，1998，18(2)：10-12．

[8] KASTNER J R，EITEMAN M A，LEE S A．Effect of red ox potential on stationary-phase xylitol fermentations using Candida tropicalis[J]．Applied Microbiology and Biotechnology，2003(63)：96-l00．

[9] 關德師．甲烷菌的生存條件與生物氣[J]．天然氣工業(yè)，1990，10(5)：13．

[10] HAE SUNG JEE，NISHIO NAOMICHI，NAGAI SHIR0．Influence of redox potential on biomethanation of H₂ and C0₂ by methanobacterium thermoautotrophicum in Eh Stat batch cultures[J]．Journal of General Applied and Microbiology，l987，33(5)：401-408．

[11] FETZER SILKE，CONRAD RALF．Effect of redox potential on methanogenesis by Methanosarcina barkeri[J]．Archives of Microbiology，1993，1 60(2)：108-113．

[12] BOUALI．AGUI H，CHEIKH R BEN，MAROUANI L，et al．Mesophilic biogas production from fruit and vegetable waste in a tubular digester[J]．Bioresource Technology，2003，86(1)：85-89．

[13] APHA．Standard methods for the examination of water and wastewater[S]．Washington DC：American Public Health Association，1998．

[14] 張英，王曉波，李瑾，等．不同類型有機質生物產甲烷模擬實驗研究[J]．石油實驗地質，2009，31(6)：633-636．

本文作者：夏大平陳鑫 蘇現(xiàn)波 吳昱

作者單位：河南理工大學能源科學與工程學院  河南理工大學資源環(huán)境學院